L’Associazione A.I.LAM – ONLUS, per l’anno 2019/2020, grazie all’aiuto di tutti i suoi sostenitori, ha deciso di istituire una borsa di studio per l’attività formativa a supporto di un progetto di ricerca di base e/o applicata sulla Linfangioleiomiomatosi. L’Associazione intende fornire un supporto per lo svolgimento di un progetto di ricerca da sviluppare nell’arco di 12 mesi presso Istituzioni Italiane di riconosciuto valore scientifico.
In data 01/03/2020 è stata conferita per 12 mesi la borsa di studio “Una Stella in cielo” (TERZA EDIZIONE) alla dott.ssa Silvia Ancona.

 
SCOPO
Lo scopo di questo progetto è di studiare il microambiente, i fattori che influenzano le cellule LAM e che da queste vengono influenzati. In laboratorio abbiamo già sviluppato un sistema di co-coltura con cellule LAM e cellule NON LAM che può mimare il microambiente polmonare delle cellule LAM. Abbiamo identificato alcune evidenze della capacità dei due tipi cellulari di influenzarsi come la capacità dei fibroblasti NON LAM di acquisire un fenotipo patologico diventando positivi all’anticorpo HMB45. Le cellule tumorali vivono in un complesso microambiente fatto da diversi tipi cellulari (cellule stromali, cellule infiammatorie, fibroblasti). I fibroblasti hanno un ruolo fondamentale nel microambiente, sono responsabili della produzione di fattori di crescita, della matrice extracellulare, fattori angiogenici e chemochine che promuovono la sopravvivenza delle cellule patologiche.

L’efficacia dell’anticorpo anti-EGFR nel nostro modello di topo con LAM ha dimostrato che l’effetto sul sistema linfatico e circolatorio (microambiente), e sulle cellule LAM potrebbe avere un’azione terapeutica (8,9). L’elevata espressione di EGFR o la sua attivazione costitutiva, è implicata nello sviluppo di molti tumori come quello al polmone, testa-collo, colon, cervello e mammella. Data l’importanza dell’EGF per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule LAM/TSC, lo scopo di questo progetto è anche di studiare il ruolo dell’EGF, dell’EGFR e la sua inibizione con l’anticorpo anti- EGFR sul microambiente e quello della rapamicina.

Poiché le cellule LAM/TSC possiedono caratteristiche mesenchimali e metastatiche e sono alla base della formazione dei noduli (cisti), stiamo sviluppando un sistema di coltura in 3D. Lo scopo dello sviluppo di un altro modello di coltura è di identificare un modello in vitro che possa permettere lo studio di caratteristiche specifiche per la valutazione di terapie mirate. Ci proponiamo di sviluppare sferoidi di cellule LAM/TSC e di studiare il ruolo dell’EGF e l’azione dell’anticorpo anti-EGFR. Poiché i fibroblasti stromali sono determinanti nella protezione delle cellule tumorali dalle terapie e nella progressione dei tumori (es. cancro del seno), proponiamo di sviluppare sferoidi in 3D (aggregati) formati da fibroblasti e cellule LAM/TSC che possano mimare in vitro l’interazione tra diversi tipi di cellule nei noduli di LAM. Verranno quindi valutati gli effetti dell’anticorpo anti-EGFR e della rapamicina sugli sferoidi.

OBIETTIVI
Obiettivo I: Studio del microambiente delle cellule LAM.
Dati preliminari: E’ stato sviluppato un sistema di co-coltura con cellule LAM/TSC, positive al marcatore patologico HMB45, e fibroblasti umani NON LAM/TSC, negativi al marcatore HMB45. Le cellule NON LAM/TSC sono state marcate con PKH26 (rosso) e piastrate per 24 ore, quindi sono state co-piastrate le cellule LAM/TSC in un rapporto di 5 (fibroblasti):1 (cellule LAM/TSC). Abbiamo ottenuto un modello nel quale dopo 72 ore in co-coltura si osserva, tramite immunofluorescenza, un cambiamento del?fenotipo dei fibroblasti NON LAM/TSC che diventano positivi ad HMB45 (Fig. 1 B; le frecce indicano le cellule positive a HMB45 (verde) e PKH26 (rosso), sono fibroblasti NON LAM/TSC che hanno acquisito il fenotipo patologico). La capacità delle cellule LAM/TSC d’indurre nei fibroblasti NON LAM la positività al marcatore HMB45 è stata quantificata tramite l’analisi con il citofluorimetro. L’analisi del dot plot mostra che i fibroblasti umani NON LAM/TSC in co-coltura acquisiscono positività ad HMB45 per il 53,54%. Questi dati dimostrano la capacità delle cellule LAM/TSC di influenzare l’ambiente e le cellule circostanti promuovendo l’espressione di HMB45 in un’alta percentuale di fibroblasti. Il trattamento della co-coltura con Rapamicina e anticorpo anti-EGFR per 48 ore causa la diminuzione significativa della percentuale di fibroblasti umani NON LAM/TSC-HMB45 positivi. Possiamo ipotizzare che le cellule LAM/TSC possano anche condizionare le caratteristiche fisiologico-funzionali delle cellule circostanti.

Sulla base di questi risultati, si cercherà di individuare i fattori che potrebbero controllare il microambiente delle cellule LAM/TSC studiando le caratteristiche della co-coltura:

  •   Si studieranno le caratteristiche biochimiche-molecolari dei due tipi cellulari in co-coltura tramite citofluorimetria analizzando la fosforilazione di S6, target di mTOR, e dopo trattamento con anti-EGFR o rapamicina.
  •   Per verificare se l’efficacia della rapamicina e dell’anti-EGFR è simile in colture singole e in co-colture, che mimano il microambiente, verranno studiate la proliferazione e l’apoptosi nelle due condizioni cellulari.
  •   Nei terreni delle co-colture verranno analizzati, tramite ELISA arrays, vari fattori che possono essere determinanti nell’influenzare il microambiente LAM come TGFβ (componente importante nel ruolo delle cellule stromali per il rimodellamento), TNFα, PDGF, AREG, EGF,  VEGF, FGF, BDNF, IL-1 o -6 o -8.
  •    Per verificare se ci sono fattori secreti dalle cellule LAM o dai fibroblasti NON LAM che controllano il microambiente, i fibroblasti NON LAM/TSC verranno incubati con il terreno di coltura delle cellule LAM/TSC e verrà analizzato il fenotipo tramite positività ad HMB45 in citofluorimetria.

Obiettivo II. Studio del microambiente delle cellule LAM tramite un modello cellulare in 3D

Dati preliminari: Nel nostro laboratorio stiamo sviluppando un modello cellulare di LAM in 3D nel quale le cellule LAM sono coltivate nel loro terreno di crescita (Type II complete) a cui è stato addizionato matrigel al 2% per 48 ore di coltura. Abbiamo osservato la formazione di sferoidi di cellule LAM (Fig.2) che pensiamo possa costituire un modello utile a comprendere le interazioni tra i diversi tipi cellulari in una condizione simile a quella in vivo che mima i noduli e le cisti.

Lo scopo è di utilizzare questo modello per studiare l’efficacia di farmaci in un contesto più completo rispetto alle colture cellulari classiche:

  • Verranno valutati gli effetti di agenti farmacologici quali anticorpo-anti-EGFR o rapamicina sulla proliferazione e l’apoptosi negli sferoidi paragonando l’azione con quella sulle colture classiche (2D) di cellule LAM.
  • Verrà sviluppato un sistema in 3D con fibroblasti NON LAM/TSC e cellule LAM/TSC che verrà caratterizzato, tramite immunofluorescenza e citofluorimetria, per positività ad HMB45 (fenotipo patologico), fosforilazione di S6 e proliferazione.
  • La proliferazione e l’apoptosi della co-coltura in 3D verranno analizzate in seguito ad incubazione con anti-EGFR o rapamicina.

 

Dott.ssa Silvia Ancona

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