“NODULI POLMONARI E ALTERAZIONI UTERINE IN UN MODELLO MURINO DI LAM.
STUDIO ISTPATOLOGICO ED EFFETTO DEL TRATTAMENTO CON RAPAMICINA E/O ANTICORPO ANTI-EGFR”.

Questo progetto nasce in seguito alla mia esperienza maturata presso i laboratori di Farmacologia del Dipartimento di Scienze della Salute (Polo San Paolo) dell’università degli Studi di Milano dove ho svolto il tirocinio di tesi e il dottorato di ricerca dedicandomi allo sviluppo di un modello animale di LAM.
I risultati ottenuti in questi anni hanno portato il nostro gruppo di ricerca alla pubblicazione dell’articolo “Development of a Lymphangioleiomyomatosis model by endonasal administration of human TSC2(-/-) smooth muscle cells in mice” (Lesma E, Chiaramonte E, et al., 2012) dal quale è emerso che, somministrando per via endonasale cellule isolate da una paziente TSC (cellule TSC2-/- ASM), in topi immunocompromessi è possibile creare un modello che presenta alcune lesioni tipiche della LAM. Infatti, le cellule TSC2-/- patologiche sono in grado di invadere i linfonodi e i polmoni causando un aumento della dimensione degli alveoli e riproducendo un quadro patologico simile a quello osservato nelle pazienti LAM (Lesma E, Chiaramonte E, et al., 2012). I trattamenti con la rapamicina e soprattutto con l’anticorpo anti-EGFR sono risultati efficaci nel ridurre il danno polmonare.Il progetto di ricerca “Noduli polmonari e alterazioni uterine in un modello murino di LAM. Studio istopatologico ed effetto del trattamento con rapamicina e/o anticorpo anti-EGFR” ha lo scopo di approfondire lo studio delle alterazioni causate dalla somministrazione endonasale di cellule isolate dal chilotorace di una paziente LAM/TSC. Queste cellule, isolate recentemente nel nostro laboratorio, possiedono caratteristiche intrinseche della LAM e quindi sono in grado di causare un quadro più completo delle lesioni patologiche quali, per esempio, la formazione di noduli polmonari.
Inoltre, le cellule LAM/TSC sono caratterizzate da un’elevata attività migratoria e metastatica che potrebbe favorire la loro migrazione a numerosi organi bersaglio tra cui l’utero. La possibilità di riprodurre manifestazioni anche a livello uterino o caratteristiche dipendenti dal sistema ormonale potrebbe essere un valido strumento per comprendere come il sistema ormonale agisce nella patogenesi della LAM.
Infine, uno dei punti fondamentali nello studio della LAM è la necessità di individuare un trattamento efficace. Come detto precedentemente, nel modello creato con le cellule TSC2-/- ASM (Lesma E, Chiaramonte E, et al., 2012), la somministrazione di rapamicina o dell’anticorpo anti-EGFR ha dato buoni risultati, con efficacia maggiore da parte dell’anticorpo anti-EGFR. Studiare l’azione di questi farmaci in un modello creato con cellule ad elevata invasività permetterebbe di valutare il miglior trattamento o la possibilità di una terapia combinata.L’attività di ricerca che vi ho appena descritto non sarebbe possibile senza il vostro prezioso aiuto. Il vostro impegno, la vostra costanza nell’organizzare numerosi eventi di sensibilizzazione e raccolta fondi, ma soprattutto la vostra presenza è fonte di stimolo e sostegno continuo. A voi, quindi, va il mio grazie per aver scelto il progetto di ricerca presentato e per il costante aiuto al gruppo di ricerca del laboratorio di Farmacologia del Dipartimento di Scienze della Salute (Polo San Paolo) di Milano.

Dott.ssa Eloisa Chiaramonte

– Lesma E, Chiaramonte E, Isaia E, Grande V, Ancona S, Orpianesi E, Di Giulio AM, Gorio A. Development of a lymphangioleiomyomatosis model by endonasal administration of human TSC2-/- smooth muscle cells in mice. Am J Pathol. 2012 Sep;181(3):947-60. doi: 10.1016/j.ajpath.2012.05.017. Epub 2012 Jul 4.

Relazione I QUADRIMESTRE
24.9.2012 – 23.01.2012

Utilizzando le cellule isolate dal chilotorace di una paziente LAM/TSC abbiamo creato un modello animale che presenta un quadro patologico simile a quello presente nelle pazienti LAM. La somministrazione delle cellule LAM/TSC in topi immunocompromessi causa, infatti, un aumento della dimensione degli alveoli e invasione del sistema linfatico compatibile con il quadro osservato nelle pazienti LAM.
In questi primi mesi la mia attività si è concentrata su un’analisi più approfondita del tessuto polmonare degli animali. Infatti, oltre a un’elevata apertura alveolare abbiamo osservato anche la formazione di noduli polmonari. Generalmente nelle pazienti i noduli sono distribuiti in modo irregolare nel parenchima e possono essere di diverse dimensioni. Nel modello creato nel nostro laboratorio un’elevata percentuale di animali presenta questo tipo di alterazione che si riduce in seguito a trattamento farmacologico con anticorpo anti-EGFR o rapamicina. Analizzando nel dettaglio i noduli polmonari è stato osservato che nel modello animale la loro localizzazione è specifica, infatti si concentrano prevalentemente in prossimità dei vasi e delle vie aeree. Nei noduli sono state osservate cellule umane suggerendo che la loro presenza sta alla base della formazione dei noduli. Inoltre, la fosforilazione si S6 è risultata molto elevata, una caratteristica delle cellule LAM e TSC.
Infine, è stata effettuata un’analisi preliminare del tessuto uterino che ha permesso di identificare cellule umane nella fascia del miometrio. L’identificazione delle cellule in questo tessuto conferma non solo l’elevata capacità migratoria, ma anche l’invasività delle cellule LAM/TSC.

Dott.ssa Eloisa Chiaramonte

Relazione II QUADRIMESTRE
24.01.2013 – 24.05.2013

Nella seconda fase della mia attività ho continuato la mia ricerca sulla caratterizzazione dei noduli polmonari, la valutazione della capacità migratoria delle cellule LAM/TSC e la stima del danno polmonare nel nostro modello. Alcune cellule nei noduli polmonari presentano la proteina alfa-actina che è fortemente espressa anche nelle cellule e nei tessuti delle pazienti LAM. Nella ricerca sulla LAM, uno degli aspetti più innovativi riguarda lo studio delle caratteristiche metastatiche e migratorie delle cellule patologiche che nella LAM risulta particolarmente importante per comprendere la progressione della patologia e il coinvolgimento di vari organi. In questo progetto abbiamo analizzato, quindi, alcuni organi potenzialmente coinvolti da alterazioni e dalla capacità invasiva delle cellule, quali l’utero e i linfonodi. Nella relazione precedente, abbiamo dimostrato che le cellule LAM/TSC hanno un’elevata capacità migratoria, infatti, sono state individuate a livello uterino oltre che nel polmone. Nei noduli polmonari è stata osservata l’espressione della forma fosforilata di ERK, una proteina implicata nella migrazione cellulare. Sulla base di questi risultati abbiamo deciso di esaminare i linfonodi, coinvolti nelle manifestazioni patologiche della LAM e che rappresentano uno degli organi maggiormente interessati nel processo metastatico. Le cellule LAM/TSC raggiungono i linfonodi degli animali trattati e, in alcuni casi, formano dei piccoli gruppi (clusters). Questi dati indicano che le cellule LAM/TSC sono in grado di migrare e depongono a favore della teoria metastatica benigna dimostrando la corrispondenza del nostro modello al quadro patologico. Nei polmoni abbiamo osservato un anomalo aumento del numero di vasi sanguigni, probabilmente coinvolti nell’invasività delle cellule LAM/TSC, che diminuisce in seguito al trattamento con anticorpo anti-EGFR o rapamicina. Dal momento che la LAM è una malattia progressiva, abbiamo analizzato il nostro modello 3, 6 e 12 mesi dopo la somministrazione delle cellule patologiche. La dimensione degli alveoli aumenta progressivamente nel tempo e i noduli polmonari, che sono assenti a 3 mesi dalla somministrazione delle cellule, si osservano a 6 mesi e in numero maggiore dopo 12 dalla somministrazione . Questo quadro è indicativo di un danno progressivo simile a quello patologico e simula l’evoluzione della malattia osservata nelle pazienti LAM.

Dott.ssa Eloisa Chiaramonte

Relazione III QUADRIMESTRE
24.01.2013 – 24.05.2013

Nella terza fase della mia attività di ricerca mi sono occupata principalmente di valutare le alterazioni a livello uterino nel modello animale da noi generato. L’importanza di questa valutazione deriva dal fatto che l’utero è uno degli organi colpiti nelle pazienti LAM e che alcune ricerche lo hanno indicato come la “sorgente” delle cellule patologiche nella LAM. Infatti, le cellule LAM migrano nell’organismo e possono colonizzare il polmone anche dopo trapianto polmonare. Gli estrogeni hanno un ruolo importante nella patogenesi della LAM promuovendo la migrazione e la proliferazione delle cellule; inoltre, questi ormoni sono fondamentali per lo sviluppo dei leiomiomi. Abbiamo, quindi, valutato l’espressione dei recettori per gli estrogeni e quello per il progesterone nell’utero degli animali a cui sono state somministrate le cellule LAM/TSC individuando un aumento significativo dei recettori estrogenici e progestinici. Inoltre, nell’utero la presenza delle cellule umane è associato a un significativo aumento del numero dei vasi sanguigni mentre i vasi linfatici non risultano alterati. I trattamenti farmacologici con anticorpo anti-EGFR e rapamicina agiscono efficacemente nel contenere le modificazioni appena descritte riportando l’espressione dei recettori di estrogeni e progesterone a valori paragonabili a quelli degli animali che non hanno ricevuto le cellule LAM/TSC e riducendo significativamente il numero dei vasi sanguigni. I recettori degli estrogeni e quello del progesterone sono fortemente presenti nei noduli polmonari del nostro modello animale con un ruolo probabilmente di stimolazione della loro formazione, confermando la validità del nostro modello che riporta gran parte delle caratteristiche patologiche.
Le cellule umane somministrate per via endonasale negli animali sono in grado di migrare all’utero e di indurre alterazioni simili a quelle delle pazienti. Tuttavia, dall’analisi morfologica non è stato possibile rilevare alterazioni tipicamente morfologiche né lo sviluppo di leiomiomi. La crescita dei leiomiomi è dipendente dalla presenza di estrogeni e probabilmente nel nostro modello un’insufficiente presenza di ormoni non ha condotto alla loro formazione.
In conclusione, il modello animale da noi proposto con la somministrazione delle cellule LAM/TSC presenta caratteristiche morfologiche, biochimiche e molecolari simili a quelle evidenziate nelle pazienti e, quindi, risulta di grande utilità per lo studio delle lesioni patogenetiche della LAM e per l’analisi di nuovi possibili farmaci. Nel nostro modello animale l’anticorpo anti-EGFR risulta più efficace nel contenere le alterazioni patologiche.

Dott.ssa Eloisa Chiaramonte